景通仪器荧光显微镜专场:
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倒置荧光显微镜  正置荧光显微镜 

荧光显微镜是荧光显微检测的专用工具，它是光学显微镜的一种，是对某些物质进行定性和定量研究的工具之一。

细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光。

荧光显微镜的成像机理是利用波长较短的光照射样品时，会发射出波长较长的光谱，当照射光停止照射时，这种激发的荧光会立即消失。

荧光显微镜根据照明方式的不同可分为透射式与落射式，但由于透射式对眼睛易造成伤害，因而常采用落射式照明。

近年来荧光显微成像技术得到了广泛的应用与发展，已形成了荧光生物显微镜、荧光体视显微镜、荧光偏光显微镜、荧光寿命成像分析显微系统等。

下图为落射式荧光显微镜的照明原理图。

1、荧光的分类

（1）自然荧光（或称一次荧光、自发荧光、自体荧光和原发荧光）

某些物质勿需经过处理, 当受到激发光照射就能产生荧光的称为自然荧光。如植物的叶子、茎；动物的一些组织：牙齿、骨质、爪甲、白头发、尿液、血浆及维生素等；某些结晶体、有机化合物、合成物、油类、蛋白质、腊等。所以自然荧光在造纸、纤维、染料、化学药品、食品和油脂等工业方面被用作检查和鉴别；在环保中对大气污染公害的监测中也用紫外线进行粉尘荧光观测。

荧光显微镜初期就用于观察动、植物标本的自然荧光。

（2）人工荧光（或称二次荧光、继发荧光、染色荧光）

某些物质必须经过化学处理，如用染料、荧光色素与其结合，才能在激发光下发射荧光。

所谓荧光色素是一类能产生明显荧光，并能作为染料使用的有机化合物。它有天然和人工合成两类，后者常用的有数十种之多，如吖啶橙、罗达明等。荧光色素也叫作荧光染料，这样非荧光试样通过有选择的荧光色素进行染色后，在荧光显微镜下就可从颜色和反差中清晰地分辨其中不同的细胞组织。

染色荧光方法在细胞化学和组织化学中很早就应用了，如用盐基黄对结核菌染色是常见的。

免疫荧光也称为荧光抗体法，它在1950年由美国生物学家试验成功，该生物学家也因此获得诺贝尔奖。几十年来，荧光抗体法在细菌学、病毒学、免疫学、免疫病理学、寄生虫学、肿瘤学方面均得到应用。此外，荧光在农业科学、生物学、古生物学、兽医学等方面也获得广泛应用。

2、荧光的特性

归纳起来，荧光具有以下特性：

（1）物质欲发射荧光，必须吸收激发光能。在常温下所发出的荧光波长较激发光长，能量较激发光弱。

（2）物质荧光的光谱特性是固有的，当它接收特定的激发光吸收，就会发出固有荧光色，因此依据荧光的特异性可判断是什么物质。

（3）荧光发出时，不像普通光那样会产生热效应，它是冷光。荧光随激发光停止照射时，在10-7s～10-8s间内消失。

（4）荧光的衰减与猝灭荧光的衰减是指在受激发光照射期间，发出的荧光光强的减弱。衰减的程度取决于激发光强度和照射时间。采用高强度激发光时其衰减要显著得多，有时在1秒的间隔内，荧光就会大大减弱。荧光还有猝灭现象， 特别对于继发荧光，这是一种复杂的现象，由于处于激发状态的荧光色团分子发生了变态，导致荧光量子产量的减少，这样便缩短了荧光的发射。

3、荧光显微镜的基本组成

荧光显微镜是荧光显微检测的专用工具，它是光学显微镜的一种。它除了具有光学显微镜的基本结构和光学放大作用外，基于荧光的特性，还具备以下独特的功能要求：

（1）提供足够能量的能激发出荧光的光源。

（2）有着适应不同物质所需的激发光谱——组滤色片。从光源中选择合适的激发光谱，使析出的光谱与该物质的吸收光谱重合，以期望获得最大的荧光。

（3）为获得较弱的荧光图像，还要建立一套截止滤色片，它使所需观察的荧光进入系统成像，而将其余的光波，包括发射光阻挡在外，用来提高图像的衬度。

（4）放大的光学系统应适应荧光的特性，最终获得既能观察又能摄影的高亮度、高分辨率的良好衬度的荧光图像。

（5）仪器的安全性。应用汞灯要防止紫外线的泄漏和汞灯的爆炸，保证电器安全。

4、荧光显微镜的光源

荧光色素的平均吸收波长峰值从紫外340 nm到黄绿光595 nm，具有这些光谱的强光源有超高压汞灯、超高压氙灯和大功率的卤素灯。超高压汞灯是荧光显微术中最常用的光源，它是利用金属汞蒸汽在超高压下放电发光原理制成的，发光光谱为280 nm~600 nm，具有不连续的线条光谱特性，有的波段特别明亮。超高压汞灯发光时，泡内产生50~70个标准大气压，它的引燃电压很高，工作时维持电压较低，灯的寿命与启动次数和工作时间有关，启动次数愈多，每次工作时间愈短，寿命愈短。生产厂家在出厂时应给出规定平均寿命，如德国莱茨公司规定每启动一次工作3h，共启动70次为准，平均寿命为200h；日本奥林巴斯公司平均寿命是400h。使用中，当灯泡变黑或达规定时间应调换灯泡，否则除了灯的光度下降外，还有可能出现爆炸事故。熄灭后一般约15分钟方能完全冷却，在未完全冷却时，切勿打开灯室，因热灯泡内压力很大，聚冷会引发爆炸。

5、荧光滤色片组

滤色片组是荧光显微镜的关键部件，由激发滤色片（Excitation filter / EX）、截止滤色片（Emission filter / EM）和二向色分光镜（Dichromatic mirror / DH）组成。激发滤色片的功能是从光源中分析出所需的特定光谱，以激发标本产生荧光；截止滤色片的功能是仅把标本上发出的荧光透过成像，而将其它光阻挡不参与成像。一般激发滤色片安置在紧靠光源，而截止滤色片在物镜与目镜之间。按其透过光谱特性曲线可分为“短波通过”、“长波通过”和“波段通过”滤色片。波段通过滤色片按波带宽度又可分为“宽波带”和“窄波带”滤色片，如果半宽带（即 50%的透射峰的主透射带的宽度之半）大于50 nm ，视为“宽波带型”；若小于20 nm，则可视为“窄波带型”。

截止滤色片要阻挡非荧光在像面上出现，来自被检物体的杂散光和反射光一旦进入观察系统后会使衬度降低，因为它比荧光具有更高的亮度。对于截止滤色片的要求是它的光谱特性和它是否产生自发荧光。设计截止滤色片的光谱特性时，除了要考虑荧光的发射光谱外，还需注意到激发光谱往往与发射光谱有一重叠区的处理。

二向色分光镜是落射式关键部件，它是多层膜干涉滤色片，与主光路呈45°安置，二向色分光镜将光源发出的光谱分为两段（故称二向色），一段反射作为激发光，一段透过荧光。显然二向色分光光谱段太宽，还必须配备激发滤色片和附加的截止滤色片适应荧光观察。

6、光学成像系统

荧光显微光学系统需要优先考虑的是：

（1）光学系统组成的材料应选用在激发光波内无荧光材料，不但指光学系统玻璃，也包括胶合制造中的胶合剂、切片、盖玻片和浸液以及密封剂。若有自发荧光，不但会增加背景光，有时还会混淆观察荧光图像。

（2）光学系统的参数选择中，应将获得最大光能作为第一考虑因素。照明系统中一般采用柯勒照明并使灯丝或弧光像充满入瞳，以期望获得高效率的均匀照明。物镜一般选择数值孔径大的物镜。

（3）双目镜筒作为荧光用时应在可见光谱段有较高的透过率，采用镀膜技术可大大地减少光能的损失，它可比一般双目镜筒透射率提高一倍，这对弱荧光物质观察是必须的。

（4）目镜放大率不宜选大，因为像面照度与目镜放大率平方成反比。若其它条件相同当用6.3X目镜时，照度定为100%，换上12.5X时，照度约为25%，因此常用10X平场消色差目镜即可。

（5）系统各组成部件的光谱特性也是至关重要的，特别是紫外光要通过的部件，如照明系统、聚光镜以及物镜，要关注紫光区的透射系数。聚光镜要选用透紫外线的材料；照明系统中反光镜表面镀铝比镀银好，因为铝在UV和V区反射率在90%以上，而银仅达70%。加拿大胶吸收紫外线，在紫外区通过处不宜用作胶合剂。

7、荧光镜检术的注意事项

（1）激发光长时间的照射，会发生荧光的衰减和淬灭现象，因此尽可能缩短观察时间，暂时不观察时，应用挡板遮盖激发光。

（2）作油镜观察时，应用“无荧光油”。

（3）荧光几乎都较弱，应在较暗的室内进行。

（4）电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。

8、常见荧光色素的吸收和发射光谱