内反射荧光显微术（Total internal reflection fluorescence microscopy，TIRFM）

利用全内反射产生的消逝波激发样品，使样品表面数百纳米厚的薄层内的荧光团受到激发，再用高灵敏度和高时间分辨率的摄像机CCD来捕捉荧光并用计算机进行显像，从而实现对生物样品观测的一种新生技术。由于消逝波特点及CCD的优势使全内反射荧光显微镜具有高信噪比和高时间分辨率，因此它在对单分子的动态观测具有很高的应用价值。

全内反射荧光显微镜根据其结构的不同可分为目镜型和棱镜型两种。

1.棱镜型全内反射荧光显微镜

棱镜型全内反射荧光显微镜就是利用激光经过棱镜并产生全内反射，其消逝波照射已被荧光标记的生物样品，其激发光从另一侧进入目镜，并被CCD相机捕捉，其光路图如图所示。

从光路图我们可以看出，棱镜型系统在实现上更加容易,它只需要激光光源、棱镜和显微镜，它也不容易受到入射光信号的干扰，但由于消逝波在ｚ轴方向上呈指数衰减，只能照射100nm的距离。在探测上，放置样品的空间收到棱镜的限制。另外由于目镜和物镜同样品距离近，因此同其他仪器的配合也受到限制。目前棱镜型全内反射荧光显微镜的发展很慢，在科学研究中一般很少用到。

2.物镜型全内反射显微镜

在物镜型全内反射显微术中，显微镜的物镜即作为收集样品荧光信号的接收器，同时又作为发生全内反射的光学器件，如图所示。

由于细胞的典型折射率为1.33～1.38 ，因此要想实现全内反射，物镜的NA必须大于1.38。表达式为：

NA = nsinθ，nsinθ> nsinθc

NA为物镜的数值孔径，n、θ分别为物镜的折射率（浸没油）和孔径角。θc为发生全反射的临界角。当我们使用NA值为1. 4 的透镜物镜时，只有很小的一部分物镜孔径范围(1.4 -1.38=0.02)可以被利用，这显然增加了光束校准的难度，同时光束的强度也很难提高。如果我们使用NA=1. 65的透镜物镜，则有一个大的多的孔径范围(1.65-1.38=0.27)可被利用，即有更多的激发光强可以用来产生全反射。

物镜型的全内反射荧光显微镜在制作要求的技术很高，它是近年来全内反射荧光显微镜的发展方向，由于它的物镜同收集样品荧光的仪器在同一侧，这有助于同其他的仪器等的结合。

内反射荧光显微镜的优势应用和发展展望：

全内反射荧光显微镜里用消逝波作为阳品的激发光源，并用有着高灵敏度和高时间分辨率的CCD相机捕捉样品荧光，因此具有如下优点：

1.信噪比高（相对共聚焦显微镜）；

2.分辨率高（相对其他的光学显微镜）；

3.对生物样本损伤小（相对电镜），可以进行活体物质的研究和单分子的动态研究。

全内反射荧光显微术正是凭借其独特的优势，它的荧光激发深度只在～100nm的薄层范围内，从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术。

全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成像，大大提高了成像速度，可以满足实时成像的要求；另一方面它的图像解释相对于近场，干涉显微成像来说也较简单。

现在全内反射荧光显微术已被广泛用于实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动、单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移(FRET)、ATP酶的翻转、聚合物内单个分子的结构变化以及等离子体膜附近的神经分泌腺的颗粒运动等多方面，如肌球蛋白酶活性测量，肌收缩力的产生，荧光标记驱动蛋白动态研究，蛋白的构像的动态变化。

全内反射荧光显微术的发展一方面会在加强传统优势的基础上，即动态观察生物大分子的结构、相互作用、物质的分泌，同时，在不断的改进物镜和CCD相机的性能基础上进一步同其他仪器的结合，更多的用在生物细胞活体方面的研究。