实验一  普通光学显微镜的结构和使用

一、实验目的

• 1.了解普通光学显微镜的构造及成像原理
• 2.掌握低倍镜、高倍镜的正确使用方法

二、实验原理

普通光学显微镜主要由物镜和目镜组成，均为凸透镜。物镜的焦距（f1）短，目镜的焦距（f2）长。物镜到标本（AB）的距离稍大于物镜（Lo）的焦距，标本经物镜放大后，形成放大倒立的实像A’B’，实像A’B是目镜的物体，它位于目镜的焦点以内，所以 A’B’经目镜（Le）再次放大后，形成放大的虚像A”B”（如图1-1所示）。

图1-1 普通光学显微镜成像原理图

三、实验用品

• 1.材料与标本：字片、红绿羊毛交叉片、人血涂片。
• 2.器材：显微镜、擦镜纸。
• 3.试剂：香柏油、二甲苯(或乙醚-酒精混合液，比例为2:3）。

四、实验步骤

1.显微镜的结构：

普通光学显微镜由机械部分、照明部分和光学部分组成（见图1-2）。

图1-2 普通光学显微镜

（1）机械部分：

显微镜的机械部分包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗调手轮、微调手轮等部件。

• 1）镜座：镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。底座和镜臂起稳定和支撑整个显微镜的作用。
• 2）镜筒： 镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm，此数字通常标在物镜的外壳上。镜筒有单筒式、双筒式两种，单筒式镜筒又分直立和倾斜式，而双筒式镜筒均为倾斜式。
• 3）物镜转换器：物镜转换器上可安装3~4个接物镜，一般是三个接物镜（低倍、高倍、油镜）。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。
• 4）载物台：载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。
• 5）推动器：是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分,在第一次检查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。
• 6）粗调手轮（粗螺旋）：粗调手轮是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件，老式显微镜粗调手轮向前扭，镜头下降接近标本。新近出产的显微镜镜检时，右手向前扭载物台上升，让标本接近物镜，反之则下降，标本脱离物镜。
• 7）微调手轮（细螺旋）：用粗调手轮只可以粗放的调节焦距，要得到最清晰的物象，需要用微动螺旋做进一步调节。微调手轮每转一圈镜筒移动0.1mm（100μm）。新近出产的较高档次的显微镜的粗调手轮和微调手轮是共轴的。

（2）照明部分

安装在载物台的下方，由反光镜（光源）、聚光器和光圈组成。

• 1）反光镜：较早的普通光学显微镜是用自然光检视物体，在镜座上装有反光镜。反光镜是由一平面和另一凹面的镜子组成，可以将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜的中 央，照明标本。不用聚光器时用凹面镜，凹面镜能起会聚光线的作用。用聚光器时，一般都用平面镜。电光源普通光学显微镜没有反光镜，而在显微镜镜座上装有光源，并有电流调节 螺旋，可通过调节电流大小调节光照强度。
• 2）聚光器：聚光器在载物台下面，它是由一组聚光透镜和升降螺旋组成的。聚光器安装在载物台下，其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到最强的照明，使物象 获得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以调节，使焦点落在被检物体上，以得到最大亮度。一般聚光器的焦点在其上方1.25mm处，而其上升限度为载物台平面下方0.1mm。因此，要求使用的载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间，否则被检样品不在焦点上，影响镜检效果。
• 3）光圈：聚光器前透镜组前面还装有虹彩光圈，它可以开大和缩小，控制通过的光量，从而影响着成像的分辨力和反差，若将虹彩光圈开放过大，超过物镜的数值孔径时，便产生光斑；若收缩虹彩光圈过小，分辨力下降，反差增大。因此，在观察时，通过虹彩光圈的调节再把视场光阑（带有视场光阑的显微镜）开启到视场周缘的外切处，使不在视场内的物体得不到任何光线的照明，以避免散射光的干扰。

（3）光学部分

• 1）目镜：安装在镜筒上端，为双筒目镜，通常用10×的目镜
• 2）物镜：安装在镜筒前端转换器上的接物透镜利用光线使被检物体第一次造像，物镜成像的质量，对分辨力有着决定性的影响。一般有3-4个物镜（如图1-3所示），通常在物镜上标有主要性能指标-放大倍数和镜口率，如10/0.25、40/0.65和100/1.30。

图1-3 普通光学显微镜物镜镜头

物镜的种类很多，可从不同角度来分类： 根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为：

• ①干燥系物镜  以空气为介质，如常用的40×以下的物镜，数值孔径均小于1。
• ②油浸系物镜  常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大率为90×~100×，数值孔值大于1。

数值孔径（numerical apeature，N.A.），也叫做镜口率（或开口率）。在物镜和聚光器上都标有它们的数值孔径，数值孔径是物镜和聚光器的主要参数，也是判断它们性能的最重要指标。物镜的性能取决于物镜的数值孔径，数值孔径越大，物镜的性能越好。数值孔径和显微镜的各种性能有密切的关系，它反映该物镜分辨力的大小，数值越大，其分辨力越高。分辨力是指显微镜能够分辨物体上的最小间隔的能力，这个可分辨的最小间隔距离越近，分辨力越高。人的分辨力可达0.1mm，显微镜的分辨力能达到0.2μm。

R=0.61λ/N.A.   N.A.=n·sin(α/2)

R为分辨力，λ为光波波长，N.A.为镜口率，n为介质折射率，α为透镜锥顶角，折射率大的介质（如香柏油的折射率为1.515，空气的折射率为1），其分辨力也大。

工作距离指物像调节清楚时物镜下表面与盖玻片上表面之间的距离；物镜的放大倍数越大，工作距离越小。

2.普通光学显微镜的使用方法:

（1）低倍镜（10×）的使用

• ①将显微镜放在离实验台边缘10cm处（至少约一拳的距离）。
• ②打开显微镜的电源开关，然后使低倍镜对准镜台，开大光圈，上升聚光器并调节光亮调节旋钮至视野内光线明亮度适中。
• ③放置标本片：取一张载有标本的载玻片（以下简称玻片标本），先用肉眼观察，以确定止反面（载有标本的面为正面，一般都贴有标签）和标本的大致位置。再将玻片标本正面朝上放置在载物台并用弹簧夹夹好，用移动器移动片夹将玻片标本的标本移到载物台圆孔，聚光镜的正方。
• ④调节焦距：从显微镜侧面注视物镜镜头，同时转动粗调手轮，使得载物台上升到最高（物镜头与标本片的距离约5mm处），然后一边在目镜上观察，一边缓慢转动粗调手轮，使载物台缓慢下降至视野中出现清晰的物像。

如经过上述步骤还无法看清楚图象，应报告带教老师求的帮助，也可以重复操作一次。

（2）高倍镜（40×）的使用

• ①选好目标:一定先在低倍镜下把待观察部位移动到视野中心,将物像调节清晰。
• ②转换高倍镜物镜：为防止镜头碰撞玻片，，从显微镜侧面注视着，慢慢地转动转换器使高倍镜头对准通光孔。
• ③调节焦距：观察目镜同时稍稍调节细调手轮，即可获得清晰的物像。若视野亮度不够，可上升聚光器和开大光圈。

（3）油镜（100×）的使用

• ① 选好目标：在高倍镜下确定玻片标本上要用油镜观察的部位并移至视野的正中央。
• ② 转换油镜：转动转换器，使高倍镜头离开通光孔，在载物台圆孔上方的玻片标本处滴一滴香柏油。然后从侧面注视着镜头与玻片，慢慢转换油镜使镜头浸入油中。
• ③ 调节光亮：将聚光器升到最高位置，光圈开到最大。
• ④ 调焦：观察目镜同时调节细调手轮，使得物像清晰

若目标不理想或不出现物像需重找，在加油区之外重找应按：低倍→高倍油镜程序。在加油区内重找应按：低倍→油镜程序，以免油沾污高倍镜头。

• ⑤ 擦拭油镜头：观察完毕，先用干的擦镜纸吸掉粘在油镜头上的油，再用擦镜纸条沾少许二甲苯(或乙醚-酒精混合液，比例为2:3)擦试镜头及周围，最后用干的擦镜纸擦干多余的二甲苯。
• ⑥ 玻片标本上的油处理方法同上，只是因为玻片上的油较多，要重复2-3次才能擦干净。

五、实验记录结果与记录

1.低倍镜的练习

比较肉眼直接观察字片与低倍镜下观察物像的有什么区别?左右前后移动玻片与低倍镜下观察到的物像有什么区别？

2.高倍镜的练习

取红绿羊毛交叉片，先在低倍镜下找到羊毛，并将红绿羊毛的交叉点移到视野的中心，再换高倍镜观察，能否在交叉点同时看到两根羊毛（利用细螺旋进行判断）。

3.油镜的练习

取人血涂片，先用低倍镜、高倍镜观察，再换油镜观察。比较三种放大倍数的物镜的分辨力并练习擦拭油镜头和标本片。

六、注意事项

• 1.显微镜的光学部分不能用手直接摸擦。
• 2.不可随意拆卸显微镜的零部件。
• 3.需要更换标本片时，将物镜头转离载物台 ，方可取下或放置标本片。
• 4.转换物镜时应转动物镜上方的旋转器，切忌手持物镜转换。
• 5.要是长时间不用显微镜时，请将显微镜电光源的亮度调到最暗（维持灯的寿命）。
• 6.显微镜使用完毕后，必须复原，其具体步骤是：先转动转换器使物镜头离开通光孔，再取下标本片，下降载物台，下降聚光器、关闭光圈，玻片移动器回位，将显微镜电光源的亮度调到最暗，再关闭电源，盖上绸布和外罩，最后将显微镜放在桌子的中央。