显微镜观察

微生物—顾名思义，就是十分微小的生命体。以人类肉眼是很难看见微生物的外观，更何况是研究其外部型态以及内部构造。因此在微生物学中，使用显微镜的观察十分重要。除了观看微生物的外观之外，许多的测试以及化学作用的呈色结果，都需要依靠显微镜的观察。

 公制单位与显微镜的使用

 学习目标：于本次实验结束后你应该知道

1. 各公制单位之名称、代表数值及各单位间的转换
2. 复式光学显微镜各部位的名称及功能
3. 解剖显微镜各部位的名称及功能
4. 比较复式光学显微镜及电子显微镜之间的差异
5. 字母“ e ”经过复式光学显微镜转换后之影像
6. 如何计算视野直径及各镜头下之放大倍率
7. 如何计算镜头下各细胞及标本之实际大小
8. 依序写出使用复式光学显微镜观察之步骤
9. 光学显微镜镜头的保养方法
10. 油镜的使用方法及使用之后如何去除镜头及玻片上的油

 概述

1. 公制单位 -----采十进位法

各公制单位的名称及代表意义如下表所示：
Table 2-1. Metric Unit Values ​​& Conversion（长度单位）

Table 2-2. Metric Unit Values ​​& Conversion（重量单位）

Table 2-3. Metric Unit Values ​​& Conversion（体积单位）

同学必须熟练各单位之间的转换，例如：

3.5 cm = 3.5 × 10 -2 m = 3.5 × 10 -2 × 10 6 mm = 3.5 × 10 4 mm

转换单位之目的在于避免使用极大或极小之数字。

 2. 显微镜 ( MICROSCOPE )

    人的肉眼由于先天的限制，在25 cm的明视距离下，只能分辨相距0.2 mm以上的两点（即解析力( resolving power )为0.2 mm），对于更微小的物体，就必须借助于显微镜。无论是何种显微镜，其主要功能都在于将影像放大 ( magnification )，并增加影像的明暗对比( contrast )。

    显微镜种类繁多，依其呈像原理大致可以分为光学显微镜和电子显微镜两大类。两者差异如下表所示：

Table 2-4. A Comparison of Light and Electron Microscopes

增加光学显微镜影像的明暗对比的方法很多，例如利用染色法处理样本，或在显微镜上附加特殊装置（例如位相差显微镜、暗视野显微镜、干涉显微镜、偏光显微镜、X光显微镜、萤光显微镜、紫外光显微镜等）。

本学年同学将使用到的显微镜有双目镜复式光学显微镜及双目镜解剖显微镜两种，以下将分别介绍其各部位的名称及功能。

 (1) 双目镜复式光学显微镜

1. 接目镜：放大倍率为10×，可因应各人的双眼距离来调整，内安装有目镜测微尺，有些另装有指针，装有目镜测微尺的接目镜上有调节轮，可因应各人焦距来调整。
2. 镜筒：介于接目镜与接物镜之间。
3. 旋转盘：接于镜筒下方，通常有四个接孔，可接不同倍数的接物镜，本身可以旋转借以更换不同倍数的接物镜。
4. 接物镜：有scanning power objective ( 3.2 × )、low power objective ( 10 × )、high power objective ( 40 × )、oil immersion objective ( 100 × )四种。
5. 载物台：为放置标本玻片的平台，中央有一圆孔，可供光线通过。我们所使用的载物台为机械式载物台，上面有玻片夹及调节钮( mechanical stage control knobs )，可固定玻片及调整玻片位置。
6. 集光器( Condenser )：位于载物台下方中央，由许多透镜组合而成，用以集合光线，使之投射于标本上。
7. 光圈(虹膜) ( Iris diaphragm )：连接于集光器下方，上有一支调整柄 ( aperture diaphragm control )，可用以调整光圈孔径大小，以调整投射于标本上之光线强弱。
8. 照明器( Illuminator )：位于镜座上，内设光源为钨丝灯，直接提供观察所需之光源。
9. 镜臂( Arm )：连接镜筒及镜座，并供握取显微镜。
10. 调节轮( Adjustment knob )：位于镜柱两侧，可调整载物台的升降，以供对焦。依顺时钟方向（远离自己身体方向）旋转，则载物台上升，反之则下降（＊注意：此方向有时依机型厂牌不同而异，也有调节轮是调节镜筒之升降者，首次使用时可先缓慢旋转试试看即可确定）。
11. 镜座( Base )：显微镜之最底部。其右侧有光源调整钮，可调整照明器内光源亮度；后方接有电源线，有时尚有光源开关。

 (2) 双目镜解剖显微镜(Binocular dissecting microscope) (Stereomicroscope)

1. 接目镜( Eyepiece )：放大倍率为 8 × ( M1A机型)或10 × ( M3机型)，有些的接目镜上有调节轮( M3机型)，可因应各人焦距来调整。
2. 镜筒( Body tube )：介于接目镜与接物镜之间。
3. 接物镜( Objective )：M1A机型只有1 ×一种；M3机型则有6.4 ×、10 ×、40 ×三种，镜筒两侧有切换钮，可切换三种不同倍数的物镜。
4. 调节轮( focusing knob )：位于镜柱两侧，可调整接物镜的升降，以供对焦。依顺时钟方向（远离自己身体方向）旋转，则接物镜上升，反之则下降。
5. 镜柱( Pillar )：连接镜筒及镜座，并供握取显微镜。
6. 照明器( Illuminator )：位于镜座上，内设光源为钨丝灯，直接提供观察所需之光源（※注意：由于此光源为热光源，使用时会发热，应避免直接接触照明器，以免烫伤），开关在电源线上。
7. 镜座( Base )：显微镜之最底部。其上有载物台，为一圆盘，有黑白两色，可依需要自行变换。

 3. 复式光学显微镜的使用方法

(1) 显微镜的取用

• A.一手握镜臂，一手托住镜座，将显微镜轻轻放置在桌上，距桌缘约一个姆指距离之处。
• B.调整坐椅至适当高度，使自己可以轻松地使用显微镜。
• C.取95%酒精及拭镜纸，将所有镜头擦拭干净（※注意：仅能以单一直线方向擦拭）。
• D.将玻片标本平稳地放在载物台上，以玻片夹夹好（※注意：请确认是否夹好，以免玻片跳起，造成同学受伤或损及显微镜镜头）。

(2) 低倍镜的使用

• A.先将载物台降至最低点，转动旋转盘( Revolving nosepiece )，使低倍镜位于镜筒正下方。
• B.打开光源，调整光源调整钮及光圈( Iris diaphragm )，使视野中之亮度适当。
• C.将所要观察的玻片放在载物台上，以玻片夹夹好，并转动调节钮 ( mechanical stage control knobs )以调整玻片位置。转动调节轮 ( Adjustment knob )，至低倍镜与载物台相距约0.1 cm（或载物台无法再上升）为止。
• D.由接目镜观察，同时以靠向自己的方向缓缓转动调节轮( Adjustment knob )，使载物台下降，直到影像清晰为止。若视野太亮或太暗，皆可调整光源调整钮及光圈( Iris diaphragm )，使视野中之亮度适当。

(3) 高倍镜的使用

• A.先使用低倍镜找到欲观察的目标，将该部位调整至视野中央。
• B.重覆“ 低倍镜的使用 ”方法之A.~D.。

(4) 油镜的使用

• A.先使用高倍镜找到欲观察的目标，将该部位调整至视野中央。
• B.将高倍镜转开，加一小滴油镜专用油( immersion oil )于所见物像范围的玻片上（即光线照亮的区域），换用100倍接物镜（即oil immersion objective），小心将油镜浸于油中，重新调整光圈，并缓慢转动调节轮( Adjustment knob )，直到影像清晰为止。

(5) 注意事项

1. 严忌单手提取显微镜。
2. 若须移动显微镜，务必将显微镜提起再放至适当位置，严忌推动显微镜（推动时造成的震动可能会导致显微镜内部零件的松动，切记!!），使用显微镜请务必小心轻放。
3. 使用显微镜时坐椅的高度应适当，观察时更应习惯两眼同时观察，且光圈及光源亮度皆应适当，否则长时间观察时极易感觉疲劳。
4. 转动旋转盘时务必将载物台降至最低点，以免因操作不当而刮伤接目镜之镜头。
5. 标本染色或其他任何操作皆应将玻片取下，操作完成后再放回载物台观察，切勿在载物台上操作，以免染剂或其他液体流入显微镜内部或伤及镜头。
6. 观察完一种材料，欲更换另一种材料时，务必将载物台下降至最低点，换好玻片后再依标准程序重新对焦，切勿直接抽换标本，以免刮伤镜头或玻片标本。
7. 显微镜使用前后皆应以拭镜纸( Lens paper )及95% Alcohol清洁所有镜头，擦拭时 ​​应沿单一直线方向轻拭，不可旋转磨擦。
8. 擦拭显微镜镜头时只能用拭镜纸( Lens paper )，切勿用其他纸张或手指接触镜头。
9. 用毕显微镜应将载物台下降至最低点，并将低倍镜对准载物台中央圆孔处，将电源线卷好，盖上防尘罩，并收入存放柜中。
10. 若长期不使用，应以Xylene ( Xylol )清洁所有镜头。

 4. 放大倍数 &显微测量法

显微镜之放大倍数之近似值，趋近于接目镜与接物镜放大倍率之乘积，但由于制作时的差异，每一个镜头皆有些许不同的误差。欲得知所观察物体的实际大小，首先在目镜的两镜头之间加装一个目镜测微尺 ( Ocular micrometer )（如图2-1a所示）。在载物台上置一载物台测微尺 ( Stage micrometer )（如图2-1b所示），该测微尺为载玻片上刻有一段划分1 mm为100小格的直线，即载物台测微尺上每小格的长度为0.01 mm (10m m )。使用方法为：移动载物台测微尺，使两测微尺之一端刻度重叠成一直线，再检视另一端刻度重叠处，分别计算此一区间内，两测微尺上之格数，则目镜测微尺上每一格长度之计算如下：

图2-1（a）两种不同的目镜测微尺（Ocular micrometer）

（b）载物台测微尺（Stage micrometer）

 5. 解剖显微镜的使用方法

解剖显微镜又称立体显微镜 ( stereomicroscope )，其使用及维护方法与复式光学显微镜类似。