Spencer Smith 在实验室中使用突破性的 Diesel2p 显微镜

推进我们对人类大脑的理解将需要对神经回路如何在哺乳动物（包括实验室小鼠）中发挥作用有新的认识。这些研究需要使用显微镜监测大脑活动，该显微镜提供足够高的分辨率以观察单个神经元及其邻居。

双光子荧光显微镜显着提高了研究人员的能力，加州大学圣巴巴拉分校电气与计算机工程系副教授 Spencer LaVere Smith 的实验室是推进这项技术的研究温床。作为 NSF 资助、为期五年、耗资 900 万美元的下一代多光子神经成像联盟 (Nemonic) 中心的首席研究员，该中心诞生于奥巴马总统的 BRAIN 计划，总部位于加州大学旧金山分校，Smith 正在努力“推动多光子的前沿用于神经科学研究的显微镜。”

在 11 月 17 日的 Nature Communications 杂志上，Smith 和他的合著者报告了一种新显微镜的开发，他们将其描述为“用于大视场双光子成像 (Diesel2p) 的双独立增强扫描引擎”。他们的双光子显微镜提供了前所未有的大脑成像能力。该设备具有任何此类仪器的最大视野（高达 25 平方毫米），使其能够提供大脑多个区域的亚细胞分辨率。 

“我们正在优化三件事：查看单个神经元的分辨率，同时捕获多个大脑区域的视野，以及捕获行为期间神经元活动变化的成像速度，”史密斯解释说。“我们对成像感兴趣的事件持续不到一秒钟，所以我们没有时间移动显微镜；我们必须一次性完成所有工作，同时还要确保光学器件能够聚焦超快激光脉冲。”

驱动双光子成像系统的强大激光器，每个成本约为 250,000 美元，可提供超快、超强的光脉冲，每个脉冲的亮度都是太阳光的十亿倍以上，持续时间为 0.0001 纳秒。每秒 8000 万个脉冲的单光束被分成两个完全独立的扫描引擎臂，使显微镜能够同时扫描两个区域，每个区域配置为不同的成像参数。

新型显微技术展望：

• 工程光波有望实现快速采集3D显微镜图像
• 新型三维X射线显微镜实现对植物细胞高分辨率成像
• 独特的电子显微镜可拍摄运动中的分子
• 新的显微镜方法可能会导致细胞生物学的进步

在仪器的先前迭代中，两个激光器被轭并配置为相同的参数，这种布置强烈地限制了采样。最佳扫描参数（例如帧速率和扫描区域大小）因分布式神经电路和实验要求而异，新仪器允许对两个光束使用不同的扫描参数。这种新设备结合了几个定制设计和定制制造的元件，包括光学继电器、扫描透镜、管透镜和物镜，因其能够提供神经活动的高速成像能力而被广泛采用在广泛分散的大脑区域。

Smith 致力于确保对仪器的开放访问。早在这篇新论文发表之前，他和他的合著者就发布了一份预印本，其中包括复制它所需的工程细节。他们还与波士顿大学的同事分享了这项技术，Jerry Chen 实验室的研究人员已经进行了修改以适应他们自己的实验。

“这令人兴奋，”史密斯说。“他们不必像我们一样从头开始。他们可以建立在我们的工作之上。Jerry 的论文与我们的论文背靠背发表，INSS 和 CoSys 两家公司已经销售了基于我们设计的系统。由于没有专利，也不会，这项技术可供所有人免费使用和修改，但他们认为合适。”

双光子显微镜是一种特殊类型的荧光显微镜。为了在史密斯的实验室中进行此类工作，研究人员对小鼠进行了基因改造，使它们的神经元含有一种神经元活动的荧光指示剂。该指示剂是通过将来自水母的荧光蛋白和自然界中存在的钙结合蛋白结合而成的。该方法利用了神经元在放电时经历的短暂的、数量级的钙增加。当激光对准神经元时，神经元开始放电，钙进入，蛋白质找到钙，最终发出荧光。

双光子成像通过利用光子的量子行为来增强荧光显微镜，以防止产生大量的离焦荧光。在普通光学显微镜中，来自用于激发样品的光源的光以一种产生垂直锥体的方式进入样品，该光锥体缩小到目标聚焦区域，然后在该点下方形成一个倒锥体。任何不在最窄点的光都失焦。

VMF32A科研用三目电脑落射荧光显微镜

双光子显微镜中的光表现不同，产生一个焦点清晰的单点光（并且没有光锥），消除了到达成像镜头的所有失焦光。史密斯解释说：“图像只显示了我们正在观察的那架飞机的光，没有来自飞机上方或下方的太多背景信号。” “大脑具有光学特性和黄油般的质地；它充满了脂质和水溶液，很难看穿。使用正常的光学成像，您只能看到大脑的最顶部。双光子成像使我们能够更深入地成像，并且仍然达到亚细胞分辨率。”

双光子激发光的另一个优点是它使用能量较低、波长较长的光（在近红外范围内）。这种光在穿过组织时散射较少，因此可以清晰地聚焦到更深的组织中。此外，与较短波长的光（例如紫外线）相比，较低能量的光对样品的损害较小。

史密斯的实验室在老鼠实验中测试了该设备，在老鼠执行诸如观看视频或导航虚拟现实环境等任务时观察它们的大脑。每只老鼠的头骨都植入了一个玻璃植入物，为显微镜进入大脑提供了一个真正的窗口。

“我的动机是试图理解神经电路中的计算原理，这些原理让我们能够做一些我们目前无法在机器中复制的有趣事情，”他说。“我们可以制造一台机器来比我们做得更好。但对于其他事情，我们不能。我们训练青少年驾驶汽车，但自动驾驶汽车在人类无法做到的各种情况下都失败了。我们用于深度学习的系统是基于大脑的洞察力，但它们只是其中的一小部分，而不是全部。它们工作得很好，但仍然很脆弱。相比之下，我可以把一只老鼠放在它从来没有去过的房间里，它会跑到我够不到的地方。它不会撞到任何墙壁。它非常可靠地做到了这一点，并以大约一瓦的​​功率运行。

“有一些有趣的计算原理我们还不能在老鼠大脑中存在的人造机器中复制出来，”史密斯继续说，“我想开始发现它。这就是我想制造这台显微镜的原因。”