校准方法使显微镜能够在所有 3 个维度上进行精确测量
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左：在显微镜最佳焦点的垂直位置上方、下方和下方（从上到下）的荧光颗粒图像。校准镜头像差对颗粒图像的表观形状和位置的影响，可以使用普通光学显微镜准确测量所有三个空间维度的位置。右图：跟踪和组合来自微小旋转齿轮上的许多荧光粒子的信息，测试新校准的结果，并阐明复杂微系统在所有三个维度上的运动。来源：NIST
传统显微镜在两个维度（显微镜载玻片的平面）中提供有关样品的基本信息。但平坦并不是全部。在许多情况下，关于物体的三维信息（垂直于显微镜载玻片的轴）对于测量同样重要。
例如，为了了解生物样本的功能，无论是 DNA 链、组织、器官还是微观有机体，研究人员都希望尽可能多地了解物体的三维结构和运动。 . 二维测量会产生对样本的不完整且有时不令人满意的理解。
现在，美国国家标准与技术研究院 (NIST) 的研究人员找到了一种方法，可以将影响几乎所有光学显微镜的问题——透镜像差，它导致光的不完美聚焦——转化为一种解决方案，使传统显微镜能够准确测量光学显微镜的位置。样品上所有三个维度的光点。
尽管其他方法使显微镜能够提供有关三维结构的详细信息，但这些策略往往很昂贵或需要专业知识。在以前测量三维位置的方法中，研究人员改变了显微镜的光学系统，例如通过在镜片上增加额外的散光。此类更改通常需要在光学显微镜出厂后对其进行重新设计和重新校准。
新的测量方法还使显微镜能够更准确地定位物体的位置。光学显微镜通常将物体的位置解析到不小于几百纳米（十亿分之一米）的区域，这是由形成图像的光的波长和显微镜镜头的分辨能力设定的限制。使用新技术，传统显微镜可以精确定位单个发光粒子在百分之一小区域内的位置。
NIST 研究人员 Samuel Stavis、Craig Copeland 和他们的同事在 6 月 24 日的Nature Communications杂志上描述了他们的工作。
该方法依赖于对研究人员沉积在平面硅晶片上用于校准显微镜的荧光粒子图像的仔细分析。由于镜头像差，当显微镜沿垂直轴（第三维）上下移动特定增量时，图像出现不平衡，粒子的形状和位置似乎发生了变化。NIST 研究人员发现，即使显微镜在横向平面上仅移动几微米（百万分之一米）或在垂直方向上移动几十纳米，这些像差也会在图像中产生很大的失真。
该分析使研究人员能够准确地模拟透镜像差如何随着垂直位置的变化而改变荧光粒子的外观和表观位置。通过仔细校准粒子不断变化的外观和表观位置到其垂直位置，该团队成功地使用显微镜准确测量了所有三个维度的位置。
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“与直觉相反，镜头像差限制了二维的精度，并实现了三维的精度，”斯塔维斯说。“通过这种方式，我们的研究改变了光学显微镜图像维度的视角，并揭示了普通显微镜进行非凡测量的潜力。”
Stavis 指出，使用镜头像差提供的潜在信息补充了显微镜学家目前用于在三维空间中进行测量的不太容易获得的方法。新方法有可能扩大此类测量的可用性。
科学家们通过使用显微镜对随机沉积在一个在所有三个维度上旋转的微观硅齿轮上的荧光粒子群进行成像来测试他们的校准方法。研究人员表明，他们的模型准确地校正了透镜像差，使显微镜能够提供有关粒子位置的完整三维信息。
然后，研究人员能够扩展他们的位置测量以捕捉齿轮的整个运动范围，包括其旋转、摆动和摇摆，从而完成从系统中提取空间信息。这些新的测量结果突出了微系统部件之间纳米级间隙的后果，这些间隙由于系统制造中的缺陷而变化。正如车轮上的轴承松动导致其摆动一样，研究表明，零件之间的纳米级间隙不仅会降低有意旋转的精度，还会导致齿轮的无意摆动、摇摆甚至弯曲，所有这些都可能限制其性能和可靠性。
Copeland 说，显微镜实验室可以轻松实施这种新方法。“用户只需要一个标准样品来测量它们的效果，并使用结果数据进行校准，”斯塔维斯补充道。除了已经存在或正在出现的荧光颗粒或类似标准外，不需要额外的设备。新期刊文章包括指导研究人员如何应用校准的演示软件。