徕卡显微镜在光学显微镜查看分辨率关于一个启发式点

由于超分辨率已经成为生物医学研究中Zui被看好的方法之一，这个词越来越多的欢迎。 尽管如此，有关于什么是超分辨率是什么分辨率在所有相当大的混乱。在这里，微观解析经典视图讨论一些技术，比传统解决好了简要介绍。 右边的图像示出了两个点的距离仅仅是瑞利判据（假颜色编码）的图像的强度分布。

什么是分辨率？

在我们的情况下，分辨率是融合的相反。 当出现的东西解决了，我们就可以区分分立元件。 在显微术，有三种主要方法用来描述分辨率。 一个是阿贝公式，阿贝的名字命名。 他在透射光中研究了线性结构

图1：分辨率阿贝的定义。 假定样本来代表的周期结构，有必要收集至少第一衍射级以创建一个图像。 因此，该镜头的光圈必须足够大：N×sinα= NA≥λ/ D，带D的空间周期。 
 

该图像示出了一个光栅（上面有一些灰尘），记录有可变光圈透镜，调节到正好解决的结构。

对于有聚光镜照明，分辨的Zui小距离到达

另一种是根据约翰W.斯特拉特，谁研究点状发射器和定义的两个点图像作为光学离析，如果一个发射器的衍射图案的Zui大正值的第一Zui小值，第二的衍射图案的瑞利判据。 这导致

在这种情况下，存在两个极大值，对应于约所述Zui大值强度¾之间的Zui小亮度。

图2：瑞利判据。 两个点被认为是解决，如果一个点的中心落入其他点的点扩散函数（PSF）的第一零。 

该标准仅适用于艾里般的专业服务公司。 万一例如一个高斯分布的，没有零在所有，该标准是不适用的。 其他标准，如麻雀准则将与任何概要类型工作，因为它指的是距离，其中所述图案之间的第一导数中途消失（“高原准则”）。

很明显，当这种下降亮度甚至不太明显点仍可以区分。 因此，一般讨论的分辨率值是任意的，不能放下性质，法律不管多少数学和衍射光学理论被应用。

第三，更实际的方法是描述在半Zui大值（FWHM）的全宽,其光学悬而未决的结构。 这个值是比较容易与任何显微镜来测量，并因此成为一种普遍接受的比较参数。 理论值是

图3：左：由一个圆形的光圈点扩散函数（强度非线性增强，使暗淡的环可见）。 内点称为艾里磁盘。 右：简介通过圆形衍射图案的中心。 一个良好的，可衡量的特点是半Zui大强度全宽（FWHM =：D）。 

这一标准的优点是，它是容易测量的副分辨率特征显微图像。 用于校准或极限的测量常常不同直径的fluorochromed胶乳珠粒施加和测量。

如可以看到的，所有这些值 - 尽管具有非常不同的假设获得 - 从平均值偏离小于10％。 这使得讨论相当容易：我们知道，我们不是做一个重大的错误，如果我们简单地把FWHM为观察的分辨率参数 - 这可比简单的测量，是足够接近

这些分辨率值，从物理和数学推导的假设时，是理论上的估算。 他们假设完美的成像系统和光点在真空或完全均匀的衬底作为试样。 当然，这是从来没有在现实生活中的情况下，更遑论在日常实验室操作。 一个特别严重的假设是，光在无限供给可用。 在现实中却是没有了，可测量的分辨率的信噪比（SNR）显著依赖。 这也是显而易见的，即典型的生物样品，如脑切片做光学不表现为友好的真空。

基本上，测量结果，因此总是不如显微镜的光学分辨率。 这是要记住时，例如，检查厚和弱染色的组织切片一个特别重要的一点！ 此外，该显微镜图像是由许多衍射图案的干扰，而不是仅仅一个或两个而形成的。 要认真对待，分辨率测量必须始终包含大量的读数在不同位置的（和不同的样品中，如果可能的话），然后得到的平均值与一个错误。 这也是明显的，例如，声称“我们已经达到了197.48纳米的分辨率”是一句废话，而且肯定会更诚实地称之为“200纳米”。

什么是超分辨率？

前缀“超级”一词源于拉丁文，意思是“上面”或“超越”。 因此超分辨率用于描述技术，增强了显微镜图像的分辨率。 这立即导致混乱：它指的是（理论值）的光学拆分或可测量的分辨率的改进的改进当图像被记录时，或两者兼而有之？ 或者，它涉及到完全不同的技术，允许使用其他方法比那些经典的光学理论的更高的分辨率？ 在一定程度上，所有的这些技术可以合理地被称为“超分辨率”。 无论是技术，实际上是所谓的“超解像”与否是那么的哲学的问题或有意控制的意义。 但是，让我们离开这个讨论在这里一边赞成全面提Zui显著技术。 在这里，“分辨率”和“超分辨率”之间的界限是任意的，因此全权委托。

图像复原（卷积）

光学仪器，如显微镜，可视化形式不同的对象。 它是一种显微镜的工作来放大不能用肉眼区分，使我们可以看到它们小的结构。 不幸的是，事情总是时丢失这样的图像产生 - 我们不能不断增加放大倍数在看到小结构的希望。 这是因为物体的微观表示，无论多小，主要是由衍射的法律管辖。

图4：共聚焦光学部分的图像相比，具有细胞车厢与图像的反褶积结果。 虚线表示在右侧示出的强度分布。 表观分辨率提高了FWHMs的比较是1.6倍。 还要注意的降噪和信号的峰值强度的增加。

因此，一个点状的物体成像为一个衍射图案。 这个衍射图案是在“点扩展函数”，什么样的显微镜取得这一点的三维描述。 传播通过光学系统被称作“卷积”。 它可以计算这样的点扩散函数。 这是理想的光学和样品的假设下计算的点扩散函数看起来很辉煌。 然而，Zui好是测量它们真正的样品中，作为成像仪器和样品的影响的所有光学像差则检测为好。 解卷积的思想是将点扩散函数之一的知识应用于以恢复在该对象的原始光分布设置的三维记录的图像数据。

作为这种方法确实提高了实际记录的图像对象分离，去卷积有时被称为一个类的超分辨率技术。 略低于2×横向（x和y）方向上和略好于2×轴向改进（z）的方向权利.

共聚焦显微镜

在共聚焦显微镜中，只有一个点被照射的时间，并从该点发出的光通过一个小针孔螺纹连接到所述检测器，具有一个几乎点状探测器的影响的针孔。 粗略地说，人们已经可以从该方法推测这种类型的系统是固有地不易于卷积干扰：当整个领域被照亮，同时观察到，所有的记录的象素的数据包含其他空间元素的组分。 事实上，共聚焦成像导致非常薄的光学切片，受限衍射性质。 对于正常的实践中遇到的光学条件，Z轴的FWHM大约为XY值的两倍。 传统的显微镜 - 但是大 - 在轴向方向判断信息的可能性。

以获得从一个共聚焦显微镜中，对应于圆形孔（艾里斑）的衍射图的使用内部盘的针孔直径Zui好的结果。 这给出了一个截面厚度接近衍射极限，而不会丢失太多的光。 这是不可能的，以改善这样的条件下的横向分辨率。

图5：分辨率表演在一个真正的共聚焦（单点）显微镜针孔直径的函数（改编自曲线。光学切片性能示于黑色，红色的横向分辨率。 如果针孔具有衍射图案（1 AU由灰色线表示）的内盘的大小，进一步关闭并不能改善切片，但会增加横向分辨率。 在针孔零，切片厚度将假设的衍射极限，并且相比于广角衍射极限的横向分辨率是由√2倍更好。

所以，经典的共聚焦图象不超分辨率图像至于横向分辨率。 然而，横向分辨率由针孔光阑进一步收窄改善。 对于针孔的（当然只是理论上的）的情况下，直径为0，约1.4×的改进可以预期如图5中间（分1 AU-共聚焦），改进是可能的。 臭名昭著敏感荧光的样品，依靠高传输光学部件（AOBS和SP检测器）和一个敏感的传感器（在此，路政署是选择）。 的优点在于，没有其它的修改是必要的，除了经典的共聚焦显微镜（提供的设计满足上述提到的条件）。

分辨率在上述定义的意义上说，可以附加地通过随后的解卷积来增强。 在这里，高效率和探测器灵敏度有积极的作用，同样，如去卷积算法期望适当高信噪比。

图像扫描显微镜

另一个想法改善共聚焦显微镜的分辨率被命 名为“图像扫描显微镜”或“重新扫描共聚焦显微镜”。这种方法利用了以下事实：在一个共聚焦显微镜的图像点的FWHM是稍窄中央衍射外盘比在中心的优势。 基本上，这是相当于观测一个中心位置很差针孔导致比井中心1稍好分辨率 - 尽管这是以巨大成本的强度。

理论上，人们可以预期在大约1.5×横向分辨率的增益，如果记录在许多信道的整个衍射图像，然后分发到强度“正确”的像素。 然而，这仅适用于检测器上一个无限大的面积无限数量。 在实践中，这一因素是显著小。 如果有改进超过1.5×（例如1.7倍）一个要求，他们使用的是图像扫描和去卷积的组合。 顺便提及，这样的显微镜失去能力，以产生光的部分，作为衍射图案作为整体不再切断。 如果一个人想恢复光学切片能力，就必须限制在检测到的衍射图案的区域中，以例如1.25 AU。 然而，这是几乎相同的普通共聚焦显微镜用1.0 AU。 特别是，1.0和1.25 AU之间的强度分量仅为2％，作为一个零点交叉在1 AU; 上面和下面它也没有太大的强度。

图6：左：共聚焦（红色和黑色曲线）和再扫描（蓝色和黑色曲线）横向和轴向性能比较。 重新扫描数据适于由。如果覆盖1.25 AU衍射图案的一小部分被用于重新扫描（蓝色圆圈），横向分辨率提高了一点，但是该切片是显著恶化。 当在0.6 AU（红色圆圈）记录共聚焦，横向分辨率良好改善，并且切片性能接近衍射受限。 右：在圆形的PSF（黑色）和集成能量随半径的区域的径向强度（对应于针孔直径）。 从1 AU焦点能量VS 1.25 AU分数只有约2％的不同。

另外，这种仪器的设计通常是充满从记录象素的分割产生的其他损失。 这些损失容易加起来总强度的三分之一 ，因此比普通的共聚焦显微镜更大，例如，用≈0.6 AU的针孔直径！

结构照明

另一个不同的方法是使用结构照明的技术。 这可以通过查看所谓云纹图案，其由突出于彼此以不同的角度的顶部的两个条纹图案形成来理解。 如果一个人知道的条纹图案中的一个，并测量了莫尔图案，所以能够计算出其它的条纹图案。 这是结构照明显微镜的情况完全相同。 在已知的条纹图案是ILLUMI国，形成时的照明被折叠与该对象的结构的图案可以与一个摄像机来测量。 的两条信息，然后采取以重构第三，即结构信息。 要做到这一点，然而，人们必须在至少三个不同的照明方向和三相录制图像。 更好的结果都与5个方向和5个阶段，这意味着25个图像记录完全实现。 自然地，这需要一些时间，也科目所述样本以相当大的风险。 分辨率的增益是大约2倍。

到目前为止，所有描述的方法显示细节知名度的潜在的改进，在实现两倍的分辨率之Zui。 因此，假设的约200nm为传统的显微镜的值（使用绿光和为1.3数值孔径的物镜）的Zui好的一个可以希望用这种方法是100nm的分辨率。 下面的方法是在原则上是无限的。 决议实际达到只依赖于参数设置，样品的效率和发射器本身的尺寸。

定位显微镜

一个点的图像通过衍射图案进行说明。 在具有圆形孔的显微镜的情况下，这是艾里图案。 如果一个人可以合理地，一个光点来自于一个单一的发射器（“单分子显微镜”），可以测量产生的艾里人物，演绎排放焦点。 一者来确定所述荧光电子系统的中心，因此。

有多种方法用于确保真正独立的发射器被测量。 如果衍射图中重叠，但仍然可区分正因为如此，它们可以位于与分离算法。 它们可以被识别为单独的实体通过颜色编码，例如，或不同的闪烁频率。 在时间的分离是Zui常见的方法中，其中所述发射器被打开或关闭。 也有此各种开关选项：漂白（仅关断），从暗状态随机返回中，两个非发光部分的分子，由另一染料分子的灭火随机遭遇，有源开关具有不同光子能源等。 的结果始终是一个（至少暂时地）分离发射器的荧光形成在照相机芯片的艾里图案。

图7：单发射器的定位精度。 一）一个发射器（红十字会）在广场中心的理论PSF。 双箭头指示的分布（r）的大小，由该衍射图案给出。 b）在一系列单独的排放藏品，三）协调优胜劣汰PSF→（绿十字），D）的测量误差这里显示的例子的中心。 平均误差是成反比的光子贡献的测量的数量。

精度与该衍射图中，可以再次确定的中心取决于衍射图案本身（由发射波长和物镜的数值孔径确定的）的尺寸和上，可以在记录过程中被收集光子的数目单个图像的。

光子的数字越高，则较好的精确度，实际上它在理论上是可能实现无限的精度。

所以，对于给定的光的无限量的位置精度没有物理限制。 这种位置测量的坐标被传输到图像存储器和重复测量经常（几千图像）与发射器开启以随机，以获得荧光分子分布的相干图像。 相同的发射器（具有不同的结果）的多个测量值不能被排除。 在这样的图像分辨率，然后由上述的位置精度来决定。

STED显微镜

第一种方法来描述理论上是无限的分辨率使用一种现象叫做“受激发射”。这里，触发光子激活荧光染料的从激发到基态的跃迁。 每个激光发生这种现象的优势。 如在“共聚焦显微镜”所描述的，共聚焦激光扫描显微镜照射只受衍射限制区域在任何一个时间。 这一地区是辐射的原因，它的大小决定了分辨率。 因此，减小了尺寸理论上应该导致更高的分辨率。 用受激发射的技术，激发态可以发射过程发生之前熄灭。 所以，当光即适合触发激发射被引导到与激发射器的区域，在这个位置上的激发态可以被消灭或防止。 从该技术获益，人们必须确保该耗尽激光聚焦在周围的艾里图案的中心的环状。 否则，当然，所有的荧光染料将受到影响，也没有更多的图像可以被记录。 这种类型的圆形衍射图案是比较容易实现通过将相位片插入照明光路。

图8：在STED显微镜的衍射极限光点（上图）的激励。 蓝色区域是由一个衍射受限的圆形光学产生受激分子的区域照亮。 照明用环形聚焦在受激发射触发波长擦除激发区域外的特征，留下一个小区域为发射其导致增加的分辨率。

残余区域现在取决于激励面积与灭火环的“厚度”的比率。 这个尺寸是由衍射参数波长和数值孔径再次确定。 此外，然而，它也由施加到该环形聚焦的能量来确定。 在此焦点的能量被耗尽激光的功率统治。 从理论上讲，激光能量可能会承担什么价值 - 只有一个限制由目前的技术发展。 的受激发射损耗技术，因此不被衍射限定。（奥林巴斯显微镜）

实际上决定了分辨率提高效率，在一个给定的损耗激光能量参数，为饱和强度I 周六 这是一个参数是由荧光染料的光物理控制。 比I / I中的阿贝式模型的分母适当的耗尽的影响坐着实现。

图9：关于增加枯竭激光在显微镜STED影响。 第一列：激发区域。 本是恒定的所有实施例，作为激发强度不改变。 第二列：视图耗尽激光的强度增加，从上到下的衍射图案。 第三列：激发和枯竭的叠加。 第四柱：残余激励区域，这降低了与日益枯竭功率。 理论上提供衍射限制的分辨率。

STED提供了许多优点，这使得它对于现代医学和生物学研究的理想工具。 首先：它是一个即时的方法。 在一次扫描生成图像 - 随后的数量没有记录成千上万的图像运算，因为它是与定位技术的情况。 这是为生命成像以高帧频，试图做生理相关的实验时，一绝至关重要。 此外，还可以组合一系列不同荧光的，对于在空间和时间上信号的相关的一个先决条件。 虽然系统是一个不小规模的显微镜，这有一个很好的理由。 作为一个共聚焦扫描显微镜的衍生物，共聚焦显微镜固有包括作为替代的成像方法。