打破光学显微镜极限的科学家

EricBetzig, Stefan W. Hell and William E. Moerner因为超高分辨率显微镜技术获得2014年诺贝尔化学奖。

       17世纪，科学家第一次用光学显微镜（是虎克吧）研究活体细胞，打开了人类观察微观世界的大门。此后，光学显微镜成为生命科学Zui有用的工具。电子显微镜虽然有更高的分辨率，但必须经过复杂的标本处理过程，也无法观察活体细胞。

       长期以来，受到光学性质的限制，光学显微镜无法获得非常精确的分辨率。1873年，显微镜学家Ernst Abbe发表了一个著名的方程，计算出了显微镜能观察到的Zui大极限，提出影响分辨率的Zui重要因素是光线的波长。这导致科学家一直到20世纪都不敢奢望能提高光学显微镜的分辨率。根据这一说法，光学显微镜永远都无法观察区分距离小于光波波长1/2以下的两个目标，就是0.2微米，这几乎成为了显微镜领域的一个玻璃天花板。这意味着，用光学显微镜只能观察到线粒体的轮廓，比这更小的细胞结构都无法观察，观察单个蛋白分子就更别指望了。这就好像你观察细胞这个成市，只能观察这个城市内的大型建筑，但不能看到城市中的活动的居民。但为了更深入研究细胞的功能，科学家特别需要了解分子水平的细节，于是形成了一个僵局。

       这时，受激发射损毫（STED）荧光显微镜等显微镜技术横空出世，彻底打破了这个僵局。在这个历史时期，三位卓越的科学家做出了思想和技术上的突出贡献。他们获得诺贝尔奖，可谓实至名归。

更有意思的是，他们背后的故事也十分十分精彩，请看下面的介绍。

Stefan Hell

       罗马尼亚物理学家Stefan HellZui早从理论上推翻了Ernst的观点。他是首位不仅从理论上论证了，而且用实验证明了使用光学显微镜能达到纳米级分辨率的科学家。上世纪80年代，Stefan Hell发现，如果不像常规使用一个透镜聚焦，而是将两个大孔径透镜组合在一起，可以提高光学显微镜分辨率。Stefan Hell是首位发现这一现象的研究人员。1990年Hell博士毕业后，Hell决定独自一人继续在家研究以上的发现，并Zui终成功发明了4Pi显微镜。哈佛大学化学系教授Sunney了解到是Hell发明的4Pi高分辨率显微镜时，Xie对Hell勇敢挑战传统物理学观点的精神表示赞许。

       1991年，获得了德国科学基金会的奖学金，Hell带着他的4Pi高分辨率显微镜到了欧洲分子生物学实验室作博士后。当时许多科学家都认为Hell的工作对于提高光学显微镜的分辨率没有太大意义。他们认为Hell仅用他那少得可怜的科研经费来从事这项研究简直就是在冒险。1992年，Hell第一次用他的4Pi高分辨率显微镜证明了他的确能将传统光学显微镜的分辨率提高3~7倍。然而Hell只提高了Z方向的分辨率，他并没有突破衍射极限。

       此后Hell又在芬兰土尔库大学得到了他的第二个博士后职位。一个星期六早晨，Hell正躺在研究生公寓的床上看一本有关光学量子理论的书，突然灵光一闪，Hell脑海里浮现了一个想法：如果使用一种合适的激光，仅激发一个点的荧光基团使其发光，然后再用一个面包圈样的光源抑制那个点周围的荧光强度，这样就只有一个点发光并被观察到了。Hell给他的这项发明取名STED，即受激发射损耗显微镜。有了这个想法后，Hell立即行动，冲进实验室进行相关实验。每当回想起当时的心情，Hell都会觉得那是他科研生涯中Zui激动的时刻。1994年，Hell在《光学快报》上发表了关于STED的理论文章。直到多年后，这项理论才得以在实践中被证实。

       1997年，Hell与马普生物物理化学研究所签订了一份长达5年的合同，以继续他的STED研究。1999年，Hell将他的研究成果分别投给了《自然》和《科学》杂志，都被退稿。2000年，PNAS发表了Hell的成果。Hell的STED技术让人们第一次得到了纳米级的荧光图像，Hell的工作由此获得了广泛的肯定，2002年，他获得了马普研究所的终身职位。从此，Hell一直在马普研究所从事成像技术的研究工作。

W. E. Moerner

       他是观察到荧光分子的第一人。在化学领域，通过测量吸收光谱和荧光光谱，科学家可以同时研究数以百万的分子。但是化学上是检测的整体光谱，只能计算平均值。虽然如此，科学家一直梦想能分析单个分子，只有这样才能获得更丰富更准确的关于分子的信息，对生物学家来说，这样才能更好地理解生物分子的作用。1989年，W. E. Moerner是世界上第一个实现了通过吸收光谱观察单个分子技术的科学家，这是一个关键的成就。当时他正在加州IBM公司研究中心工作。这一工作给其他许多科学家从事单分子成像研究提供了思想基础。8年后，他利用绿色荧光蛋白技术将单分子成像研究推进了一步。

       1997年，W. E. Moerner到加州大学圣地亚哥分校工作，和诺贝尔奖获得者Roger Tsien一起工作，Roger Tsien正在尝试将绿色荧光蛋白变成多种颜色。绿色荧光蛋白是从水母荧光物质分离出的蛋白，利用这个蛋白和基因工程技术可以将许多蛋白进行荧光标记。

       W.E. Moerner 发现，绿色荧光蛋白能根据需要进行开关，当使用488纳米波长的光线激发时，蛋白开始发荧光，随后荧光会很快逐渐变淡，此时继续用488纳米波长的光线激发则无法继续发荧光，当时如果换用405纳米波长的光线激发，可以再次激发出荧光。而且此时发出荧光仍然是488纳米波长。就好像蛋白能复活一样。Moerner将这些蛋白分散到凝胶内，使这些蛋白分子之间的距离可以小于Abbe的显微镜观察极限距离0.2微米。天才的Moerner让这些分子在不同时间发出荧光，就好像是许多灯泡按照要求分别打开一样，他成功地突破了Abbe显微镜观察极限。研究论文1997发表在《自然》上。利用这个发现，Moerner提出用荧光显微镜可以进行单分子研究。2年后Eric Betzig实现了这个想法。

Eric Betzig

       和Stefan Hell一样，Eric Betzig也是一直希望突破衍射极限。90年代，他正在新泽西州贝尔实验室开发一种近场显微镜，近场光学显微镜是采用亚波长尺度的探针在距离样品表面几个纳米的近场范围进行扫描成像的技术。如利用孔径在20-90nm的近场探针在样品上进行扫描而同时得到分辨率高于衍射极限的形貌像和光学像的显微镜。

       近场光学显微镜能够突破光学衍射极限，虽然不是非常强大。对细胞表面结构可以进行更精细观察。

       1995年，Eric Betzig认为近场显微镜不能继续提高分辨率，另外他认为不适合搞学术研究，就停止了学术职业，他从贝尔实验室辞职，但他又不知道该干什么。但是Abbe光学衍射极限问题一直在他头脑中阴魂不散，当他在一个寒冷的夜晚散步时，一个新的想法来袭，是否可以用分子的不同性质来突破这个极限？例如可以发出不同荧光的分子。受到W. E. Moerner的启发，Eric Betzig很快使用近场显微镜实现了单分子荧光检测，然后他开始思考是否可以用普通显微镜检测能发出不同荧光的单分子。这个思路就是用显微镜对每种颜色进行分别照相，只要同一种颜色的分子距离没有小于Abbe光学衍射极限的0.2微米，Zui后将不同颜色的照片进行重叠获得不同颜色的照片，这样不同颜色的分子即使距离非常接近达到纳米水平，因为是不同时间采集的信号，所以可以进行精确区分。这正是突破光学衍射极限的理想办法。不过在当时在实施中存在一些问题，例如缺乏足够光学性质的分子。

       1995年，Eric Betzig在《光学通讯杂志》发表了他的理论思路，此后离开学术机构到他父亲的公司工作。此后多年，Eric Betzig与学术界脱离了联系。突然有一天，对科学的渴望再次让他返回了科学界。真正的突破发生在2005年，当他了解到能随意控制荧光蛋白，Eric Betzig意识到荧光蛋白的这种特征能帮助实现他10年前的想法。这些荧光分子不必要发射不同颜色，它们只需要在不同时间发射荧光就能解决问题。只用了一年时间，Eric Betzig就实现了这个技术。

       他们将荧光蛋白和溶酶体蛋白融合。使用光脉冲将蛋白激发出荧光，因为使用的光脉冲比较微弱，只有一定比例的蛋白被激发。因为发荧光的分子比例足够小，几乎所有能发荧光的分子距离都足够远，超过光学衍射极限0.2微米的距离。这样这些分子就都可以在光学显微镜下精确地分辨出来。等一会时间，当这些荧光淬灭后，再进行一轮激发和采集信号过程，这样又可以获得另外一组分子的图片。将这个步骤多次重复后，就可以获得许多张区分度良好的随机采集的目标分子照片。Zui后将这些照片叠加起来，就获得了超级高分辨率溶酶体的显微镜照片。

       The centre image shows lysosome membranes and is one of the first ones taken by Betzig using single-molecule microscopy. To the left, the same image taken using conventional microscopy. To the right, the image of the membranes has been enlarged. Note the scale division of 0.2 micrometres, equivalent to Abbe’s diffraction limit. The resolution is many times improved. Image from Science 313:1642–1645.
这确实是天才想法！他们拿到超过Abbe极限的溶酶体结果后，《科学》2006年接受并发表了他们的天才论文。

后记

       Themethods developed by Eric Betzig, Stefan Hell and W. E. Moerner have led toseveral nanoscopy techniques and are currently used all over the world. Thethree Laureates are still active researchers in the large and growing communityof scientists spearheading innovation in the field of nanoscopy. When theydirect their powerful nanoscopes toward the tiniest components of life theyalso produce cutting-edge knowledge. Stefan Hell has peered inside living nervecells in order to better understand brain synapses. W. E. Moerner has studiedproteins in relation to Huntington’s disease. Eric Betzig has tracked celldivision inside embryos. These are just a few of many examples. One thing iscertain, the Nobel Laureates in Chemistry 2014 have laid the foundation for thedevelopment of knowledge of the greatest importance to mankind.