叶绿体被膜完整度的测定

【原理】
由于铁氰化钾不能透过被膜，故完整叶绿体在等渗介质中不能进行铁氰化钾光还原的Hill反应。而失去完整被膜的叶绿体，铁氰化钾可以进入类囊体进行Hill反应。根据这一原理，比较胀破与未胀破的叶绿体Hill反应速率，就可计算叶绿体被膜的完整度。

 

【仪器与用具】
氧电极测氧全套装置（见实验20）；烧杯；微量进样器；洗耳球等。

 

【试剂】
    测定介质Ⅰ和Ⅱ  见一。
    100mmol/L铁氰化钾：称3.29g铁氰化钾溶于水，定容至100ml。
    100mmol/L NH4Cl：称0.54g NH4Cl溶于水，定容至100ml。
    适量叶绿体（20～50μg Chl/ml反应体系）。
    【方法】
    1．取0.1ml叶绿体提取液加到0.9ml的蒸馏水中并搅拌1min，使叶绿体被膜胀破，加1ml测定介质Ⅰ悬浮备用。
    2．取0.1ml未胀破叶绿体提取液加入反应杯中，视反应杯体积加入测定介质Ⅱ，加入适量铁氰化钾和NH4Cl，使铁氰化钾和NH4Cl的Zui终浓度都为1mmol/L。搅拌，平衡1min，照光测定Hill反应放氧速率，记录5min，然后清洗反应杯。
    3．将已胀破叶绿体加入反应杯中，再加入适量测定介质Ⅱ、铁氰化钾和NH4Cl，使反应体系物质Zui终浓度同未胀破叶绿体测定体系，测定过程同2。
    4．分别计算胀破和未胀破的叶绿体测定体系中单位时间的放氧量(或Hill反应速率)。
    5．计算被膜完整度。
被膜完整度（%）=
式中  A－胀破叶绿体单位时间内的放氧量（或Hill反应速率）
B－未胀破叶绿体单位时间内的放氧量（或Hill反应速率）

 

【注意事项】

    1. 本实验所用试剂要存放在冰箱中，存放时间不宜过长，Zui好现配现用。
    2. 叶绿体的分离要在0～4℃下进行，玻璃器皿和溶液都须预冷，操作要快，整个分离过程Zui好在5min内完成。
    3. 离心过程中离心机的转速不宜过高，否则叶绿体中的淀粉粒会打破叶绿体被膜。
    4. 被膜完整度的测定过程中，反应杯内破碎叶绿体与完整叶绿体的叶绿素含量应相等。