徕卡显微镜荧光蛋白光谱特性的简介

荧光显微镜的前景极大地改变荧光蛋白在20世纪50年代的发现。 其出发点是水母水母绿色荧光蛋白（GFP）通过检测Osamo下村 。 数百GFP的突变体后，荧光蛋白的范围达到从蓝色到红色的光谱。 更多的荧光蛋白来自其它物种的像珊瑚虫未来的出现偏移发射波长连到远红外区。 的可能性，这个调色板提供了科学家寻找他们的需求的绝佳选择合适的荧光蛋白标记。 本文提供的Zui新替代品的概述，并提供了明确安排表中所有相关的光谱特性。

从 A荧光蛋白 维多利亚

绿色荧光蛋白或其变体的光谱特性在于氨基酸结构上形成的发色团 （图1）。这可以是在3位的氨基酸65-67或残基的接近这个位置（例如YFP）。 除了关于发色团的主要突变，研究还对其他位点定向诱变进行，以提高其它因素，如蛋白质的成熟和表达在异种细胞系统（例如，密码子使用，蛋白质折叠在生理温度下）。 需要注意的是A. 维多利亚是一个比较原始的海洋生物，无全身发热系统。

即使GFP是因为它的亮度和高光稳定性的Zui流行的FP中的一个，它有两个主要的缺点。 这些都是一定的敏感性至pH和轻微趋势二聚化。 二聚化或寡聚化是许多FP的一个问题。 他们的偏好凝集彼此可产生伪像或关于融合蛋白的定位和功能的误解。 但是，科学家们想出了一些答案的问题了。 其中，非极性氨基酸被亲水性的物品所取代的突变，在临界位置（F223R，L221K和A206K）显示降低的二聚化。 所有这一切都导致频谱的改善以及实际性状的遗传变化进行了总结下“强化”的FP的名字。

在wtGFP的情况下，增强导致的EGFP（增强型绿色荧光蛋白）与在488nm处，而不是以前复杂的吸收光谱在395纳米和475纳米的单激发峰。 wtGFP的第一个变异版本（S65T突变）由Roger钱永健等人开发的。 比原来更亮5倍，并呈现出更短的熟化时间。 连同更好熟化效率，在37℃，根据另一个突变（F64L），这起着对人们在看活细胞中起重要作用。

一个非常有趣的GFP变体的Zui大的斯托克斯位移一个是蓝宝石 。 的突变的位置附近的发色团（T203I）导致的Zui大激发至399纳米，Zui大发射至511毫微米的改变。 这是112毫微米的斯托克斯位移。 翡翠是另一个GFP的修饰具有改进的光稳定性和亮度和更有效的折叠在哺乳动物细胞中。

而所有的绿色荧光蛋白具有相对较高的亮度，蓝色荧光蛋白通常从微观的应用减少了发光强度受到影响。 然而，它们用在因其他光谱特性的光学测定法。EBFP（增强型蓝色荧光蛋白），通过多轮突变wtGFP构成。 第一个（Y66H）跳过从绿色发光峰的蓝色光谱。 多个突变，随后，产生的蛋白质具有Zui大激发，在380nm处，并在发光Zui大值位于448纳米。 这些光谱特性使其成为EGFP在FRET徕卡显微镜的合作伙伴。 Zui近的蓝色荧光蛋白具有较高的量子产率和更好的耐光性是石青，SBFP2和EBFP2。 一个有前途的EBFP继任者是一个名为天狼这成为由于其极高的耐受性pH值（pH值从3-9稳定）和其是用Zui短的发射波长至今的荧光蛋白信誉流行的一种蛋白质。

第二个“蓝色”类的GFP变异体是由青色荧光蛋白的形成： 国家重点计划 。 酪氨酸与色氨酸（Y66W）和进一步的遗传改变的置换导致具有改善的亮度和光荧光染料。 这ECFP具有双峰的激发和发射光谱在433/445 nm 和475/503 nm纳米。 亮度是只有大约40％的该绿色荧光蛋白。 一个突出的ECFP变体是蔚蓝 ，它具有更高的消光系数和量子产率。 它比ECFP更亮的1.5倍，并用作与YFP FRET的一个伙伴。

甲GFP的突变不直接改变中的发色团的三个中心氨基酸之一导致黄色荧光蛋白的升高。YFPs具有由酪氨酸（T203Y）交换一个共同的苏氨酸，在位置203。 这种氨基酸是β桶的一部分，并位于靠近所述发色团。 相比于绿色荧光蛋白，激发和发射属性已被转换到更长的波长与激发和发射Zui大值在514纳米和527纳米（EYFP）。EYFP的一个特征是它的pH值敏感性。 在pH6.5 EYFP只有约50％的荧光，这并不总是一个缺点。 当涉及到pH测量（如囊泡，内体等），EYFP，可作为一个指标。 有趣的是，另外的突变（Q69M）开发出一种更好的酸稳定性，并显着改善了亮度（比EGFP亮的75％）。 这种蛋白质，它仍具有光稳定性较差相比，EGFP，被称为黄水晶 。 另一个YFP的突变体（F46L）呈显着更快的成熟速度并且还改进的pH值电阻。 这种蛋白质被命名为金星 ，是一种常见的FRET受体与蔚蓝。

从珊瑚虫荧光蛋白

正如人们可以从第一部分看到，大多数的FP，来自水母答来 维多利亚发射光中的蓝色到黄色的光谱。 红色荧光蛋白的缺失。 俄罗斯科学家Sergey A. Lukyanov封闭的差距时，他发现的FP的珊瑚虫。 红色的FP具有比其他的一大优势，因为在细胞中的红色光谱少得多的自体荧光。 此外，他们通过较长的波长，这是很好的活细胞兴奋。 较短波长的光确实给标本远远更大的伤害。 珊瑚蛋白的过度水母蛋白的另一个一般性的优点是在37℃下它们的有效的成熟。 而A. 维多利亚 GFP和衍生物不得不被遗传修饰，以正确的方式折叠，珊瑚虫纲蛋白成熟而不分子工程的必要性。 这可能是由于其生境的温暖水温。

图2：红色荧光蛋白的分子结构

发现在珊瑚虫Zui常用的FP的第一和静止1是红色荧光蛋白 。 这个名字是从海葵香菇芨而得。 红色荧光蛋白具有Zui大激发，在558 nm和583 nm的发射峰。 然而，第一欣快停滞时结构信息发布。 红色荧光蛋白maturates远远慢于水母的FP和具有中间色团的阶段。 这一阶段发出的光在绿色光谱和成因等FPS重叠。如已经在GFP节所提到的，红色荧光蛋白也有另一个问题。 红色荧光海葵蛋白是一种专性四聚体的倾向，以形成低聚物。 这可导致关于融合蛋白的定位和功能的误解。 在一般的珊瑚虫的FP具有相似的结构，以该多管水母FP的。 发色是藏在β桶结构，具有4纳米×3纳米（高×直径）的大小。 不同之处在于，在珊瑚虫β桶（图2）的多椭圆形外观。

与此同时，以绿色荧光蛋白“进化”，研究人员开始修改原来的红色荧光蛋白，以克服其结构性缺陷。 第二红色荧光蛋白产生- 的DsRed2 -具有减小的寡聚物形成趋势和更快的成熟速度，减少绿色发光的中间阶段。 进一步诱变导致了红色的FP其中已完全丧失其四聚体状态，但也丧失了一些它的量子产率（的DsRed2的25％）。 钱学森等人的这项工作。 是第一单体红色荧光蛋白，因此被称为mRFP1。

这mRFP1然后起点创立一组六单体的FP统称为“mFruit”的。 他们的个人名得自其发光色：mHoneydew，mBanana，魔橙，mTangerine，mStrawberry和mCherry mCherry是Zui有用的，这些FP的，具有50％的该绿色荧光蛋白的亮度发射光中的610纳米范围内。

Zui亮的FP到目前为止是mFruit派的追随者，并具有名称tdTomato。 只要它被遗传改变，dTomato是一种专性二聚体。 但二聚化被避免通过将两个二聚化的伙伴在一个分子。 两dTomato单元由一个12个氨基酸的接头偶联，产生串联二聚体的FP tdTomato具有发射Zui大值在581纳米和在Zui高的区域中的光稳定性。

发射光谱，进一步移入远红光区域（630纳米- 700纳米）已创建另一个mFruit后继时mPlum是mFruit构件与任何mFruit蛋白质在649 nm的Zui深的红色发光。

科学地使用绿色荧光珊瑚虫纲的蛋白质的量是非常小的，这是不令人惊奇鉴于公知的，用户友好的A的情况的维多利亚 GFP。 显然，人们并没有看到任何必要建立一个新的绿色荧光蛋白。 不过也有一些，比如从石珊瑚Galaxeidae，Azami绿色明亮的荧光蛋白。 其序列同源性与绿色荧光蛋白是有趣小于6％。

一个珊瑚虫纲FP这对深部组织成像的高影响Katushka。 对招标书的E.未来应用诱变 海葵 ，Katushka被鉴定为具有发射Zui大值在635纳米和所有的深红色荧光蛋白的Zui高亮度级一种二聚体蛋白质。 Katushka的单体形式被称为mKate并具有较高的亮度，供给以后，产生mKate2。

总之，所有这些今天用于显微术，荧光蛋白是来自于原始的海洋生物。 表1包括Zui重要的那些连同像激发和发射Zui大值，耐光性，量子产率和亮度及其相关的光谱特性。

展望

什么被证明是一个非常有趣的故事是由脊椎动物表达了FP的发现。 文昌鱼，一条小鱼般的海洋脊索动物，产生AmphiGFP在其前侧。 那个FP的序列分析预测一个典型的β桶结构，似乎是相关的桡足类Pontellina plumata的CopGFP（甲壳纲）。 这一发现表明，荧光的现象并不限于原始的无脊椎动物，但也可以在更高的进化阶段动物中发现。 此外，这一发现表明荧光蛋白的发现，处理和增强这仍然是研究的热门话题的持续的过程。 这一事实证实的重要性和荧光蛋白在近期和未来生命科学研究的高冲击。

荧光蛋白的光谱特性

表1：荧光蛋白
Ex：激发波长峰值（nm） 

Em：发射波长峰值（nm）

MW：分子量 
QY：量子产率 
BR：亮度; 消光系数*量子产率/ 1000 
PS：耐光性; 时间以50％的亮度（秒）