尼康显微镜荧光激发块的双激发组合

包括在尼康双波段激发荧光滤光器组合是3每个包含两个带通发射区能够通过蓝色，绿色，黄色，橙色的窄频带，和红光谱区域内有选择地分离出的荧光发射小心平衡组合。 这个交互式指南探讨了变化的激发和发射滤光器的光谱分布，以及这些的多色反光镜，如何影响在设计用于多重标记的荧光基团的双激发组合信号电平，频谱交叉，整体过滤器的性能，并且图像的对比度紫外线和蓝色或蓝绿色的区域。

本教程使用初始化出现在样品图像窗口和紫外线蓝色双通带滤波器的激发块组合（DAPI-FITC;默认值）随机选择的样本的荧光光谱图上的过滤器 ， 光谱曲线图显示。 荧光的吸收和发射光谱截面（带过滤器的传输通带重叠区域）可以通过选择在光谱截面标题中列出相应的复选框（吸收或发射 ）单独或集体观看。 当一个或多个复选框被激活，将合并的过滤器的透射和反射光谱被叠加在所选择的荧光团（多个）使用以标记样品（荧光光谱曲线中不包含自身荧光植物标本）的吸收光谱和发射光谱。 荧光团的吸收光谱示于使用褐色填充的教程，而相应的发射光谱表示用灰色填充。 由过滤器设置滑块指示的过滤器组合的波长特性显示在教程中下部的黑色矩形框。 这些值被不断地更新作为滑板平移由左到右。

为了操作的教程，使用过滤器设置滑块可用于双频励磁三滤组合之间进行转换。 当滑块从左向右平移，激发和阻挡滤光片的光谱分布，以及该多色镜的，被修饰以模拟变化的光谱图。需要注意的是连续变化的光谱曲线，但并不意味着任何过滤器的组合是可能的，也不是单独的过滤器设置可变的（无物理变化的过滤器）的问候的光谱曲线。 的选择的滤波器组之间的频谱分布的变化简单地用来帮助建立在每个光学块中使用的过滤器的组合之间的关系。

各个过滤光谱 （激发，发射和多色反光镜）可以通过选择或取消选择相应的复选框，图形下方的添加或删除的过滤器 ， 光谱曲线图。 此外，该荧光团的吸收光谱和发射光谱可以被添加或与一组类似的复选框（ 频谱截面 ）除去。 检体图像同时改变与过滤器配置文件以反映变化由改变到由滑块的翻译所产生的过滤器的组合产生的对比度和信号电平。 新的标本可以在任何时候选择使用选择的样本下拉菜单，用来标记选定样本的荧光基团直接列在菜单框下方。在所有的情况下，将样品粘有两个或更多的荧光探针以证明荧光的具有窄和宽的通带阻（发射）过滤套的选择性分离。

每个尼康显微镜双波段荧光集被优化用于结合异硫氰酸荧光素（FITC）的使用与任一4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），四甲基罗丹明异硫氰酸酯（TRITC）或Texas染料。 对应于这些荧光染料对相关的频谱区的范围从紫色激发和发射的蓝光激发的绿色和红色发光。 其他的荧光探针具有相似的光谱特性也是合适的，可单独或成对，用于与尼康双重激发荧光滤光片组合使用。

尼康DAPI-FITC双带滤波器组合结合具有一个带通区域的紫色激发块（400〜418纳米），连接到一个带通发射（屏障）过滤器发射蓝色荧光（450〜465纳米）激发滤光片在其信号的乐队之一。 第二激发和发射波长组合此过滤器集使蓝色激发在478至495纳米的窄带和检测所产生的绿色荧光，在510到555纳米范围内的。 此过滤器设定功能的双频段提供Zui佳的同时检测DAPI和FITC，当结合使用，专门针对不同的细胞成分。 在DAPI - 的Alexa Fluor 488的荧光染料对适用于该过滤器设置，以及，由于在问候的吸收和发射特性的Alexa Fluor探针和FITC光谱曲线的紧密相似性。

在双激发滤镜立方体，多色镜的设计是至关重要的两个荧光信号的分离，Zui好使它们具有Zui小串扰和噪声的独特的检测。 而相比之下，在常规的组合中使用的标准长通分光滤波器，多频带滤波器组聘请改性二色性反射镜与被精确地定位相对于所述多个激发和发射频带的多个带通区域。 第一（下部）切于波长值的反射镜定位在几纳米比短波长激发峰高，并开始一个传输频带完全围绕对应的发光峰值，随后突然传输截止。 这种设计使波长的反射在第二激发带，同时经过了第一支乐队创建的荧光发射。 在波长只是稍微比第二激发带越高，反射镜使另一个尖锐过渡到对应于所述第二发射通带的带通透射区域。 在DAPI-FITC激发块组合使用的多色镜具有适当地位于相对于每个激发块补体，是具有一个截止波长为435纳米，和另一个与截止波长的两个带通透射区域505纳米。

薄膜干涉技术中的多频带滤波器组的制造技术的应用使得有可能以平衡的两个（或更多）的荧光染料的荧光信号电平并提供Zui佳的摄像条件。 在许多过滤器的组合中，更短的（通常为紫外光或紫色）波长的激发峰的发送频带信息被减少，以平衡的发射信号电平，以及以Zui小化光致漂白和试件破坏。 这是在套设计用于与一种荧光团激发的紫光或紫外光谱区，使用特别重要，因为短波长辐射的高激发效率。 短波长激发峰的强度降低是在过滤器的组合，例如尼康DAPI-FITC组的透射光谱曲线的显着特点。

用于同时检测FITC标记的（或类似的荧光团），并激发在较长的波长，如TRITC的探针，所述的FITC-鬼笔双频带滤波器组合提供蓝色区域的激发绿色发光检测，和绿色激发伴随橙红色排放检测。 在此滤波器组，带通区域为蓝色激发绿色发光荧光素（FITC等）是从那些在DAPI-FITC集，以便Zui小化串扰的吸收绿光的荧光团采用稍加修改。 在这个组中使用的激发滤光器具有475至490纳米（蓝色激发），耦合到的503至530纳米的发射（阻挡）滤波器的通带（绿色发光），其是适合于FITC和类似的荧光团1的带通区域。

FITC-TRITC滤光器组合的第二个频带使得激发块在540〜565纳米的绿光波长范围内，并且检测对应于580和620纳米之间的区域中的橙红色发射。 虽然对FITC和TRITC荧光团的流行组合Zui优化，也可以使用探针具有相似的吸收和发射光谱特性。 多色镜（分束器）的带通区域分别位于对应于激发和发射滤波器的窗口，在500和575纳米的切口上的波长。

同时检测FITC的（或类似的探针），并激发在绿色和黄绿色光谱区波长荧光染料，具有发射延伸到红，由FITC-Texas滤光片组承担。 激发块频带为这个集（蓝色和绿色光谱区）的范围从490至505纳米，并且从560到580纳米。 相应的双绿色和红色发射频带是515至545纳米和600至650纳米，分别。 互补多色镜切口上的波长的两个信号的传输带分别位于510和585毫微米。 规格为多色反光镜和滤光片的三个尼康双频带滤波器的组合列于表1中。

尼康双频励磁过滤组合规格

表1

• DAPI-FITC -的DAPI-FITC过滤器组合被设计成用于同时从荧光染料DAPI和FITC或其它配对具有相似的光谱特性的荧光探针的检测发射。 双窄的激发和发射频段对应于紫色激发的特定区域与相应的蓝色发光和蓝色激发块耦合到绿色发光。

• FITC-TRITC -的FITC-TRITC滤光片组合是专为从荧光FITC和TRITC或探针对那些相似的光谱同时检测排放。 带通激发和发射滤光片允许两个信号通道，一个对应于蓝色激发绿色发光，另一个为绿色激发和橙红色发射的特定的窄的区域。

• FITC-Texas Red -使用FITC-Texas Red滤光片组合的设计稍有不同的带通区域为蓝色激发绿色发光时相比，FITC-TRITC集，允许FITC标记的更有效的激发块。这些变化符合稍高的波长范围为德克萨斯红（绿色激发块;红色发光）频段。 多带通地区的用户提供Zui佳的检测，以Zui小的串扰，对FITC和Texas或类似的光谱荧光双同步可视化。