怎样用间接法进行免疫荧光细胞化学染色

以下是具体的实验操作步骤：
   （1）切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。
   （2）再滴加间接荧光抗体（如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色30min，37℃，缓冲盐水洗两次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。
对照染色：
   ①抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。
   ②抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。
   ③阳性对照。
       间接法中上述方法称双层法（Double Layer Method）。另一种称夹心法，即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下：
   ①切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。
   ②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃，30min。
   ③缓冲盐水洗2次，每次5min，吹干。
   ④滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃，30min。
   ⑤如③水洗。
   ⑥缓冲甘油封固，镜检。
       间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原，敏感性较高，操作方法较易掌握，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的研究和检查，所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。